《中国药物临床》极性修复与抑癌

SurgetakeTM间皮组织细胞极性修复

与癌细胞抑制实验研究

王民1  郑青山2  王宇3 张忠涛3 李建设3 薛建国3 周延忠3

赵莉莉4杨喜花4杨永明4阎磊4白喜花4任连生4

【摘要】 目的：探讨上皮组织细胞的极性修复对肿瘤细胞抑制相关的影响。方法：分别采用细胞极性修复实验、消化道吻合口愈合影响实验、“T”管窦道形成实验、细胞极性修复相关指标检测、永生化细胞（人膀胱癌细胞株T24）抑制实验等一系列从动物实验到细胞实验，采用surgetakeTM（羧艾泰克）与生理盐水进行了对照研究。结果：兔实验兔实验组10例均实现极性修复，而对照组均无实现极性修复；同时实验表明surgetake具有较强的激活体内t-PA的活性，用药后实验组t-PA达到（1.6±0.8）IU/ml，而对照组t-PA为（0.9±0.4）IU/ml，两组比较差异有统计学意义（p<0.01）。永生化细胞（人膀胱癌细胞株T24）抑制试验结果显示，surgetakeTM组三个视野细胞数为844个，对照组3个视野细胞总数为2295个。结论：结论：细胞的极性保持对于组织修复过程的结构重建至关重要，同时细胞极性的恢复对肿瘤细胞的转归、抑制、种植具有一定的作用。

【关键词】上皮；肿瘤；组织

上皮细胞的极性(cell Polarity)，对于各器官正常功能的运转是必不可少的，对于组织修复、结构重建十分重要，同时对细胞生理功能的保持、预防突变具有重要意义。细胞极性丧失导致肿瘤的发生，细胞变成不受控制而疯狂增殖的类型。保持细胞极性的存在，实现组织的完全性修复，达到组织结构的重建对于抑制肿瘤具有重要意义。对此，我们探索了组织的极性修复与对永生化细胞（恶变细胞）的影响实验，进一步认识组织细胞极性修复与肿瘤的病理生理发展过程的影响，结果表明，细胞极性的保持与恢复可实现组织结构的重建，对永生化细胞（恶性肿瘤细胞）具有逆转与种植抑制作用。报告如下：

关键词：间皮细胞、极性修复、恶性肿瘤细胞、抑制

1.仪器与材料

1.1实验仪器：CO2培养箱（美国NuAire公司NU-5500E），低速冷冻离心机（科大创新股份有限公司KDC-2044），倒置显微镜（德国Leica 090-135.001），光学显微镜（日本Olympus CX21FS1）；酶标仪 960 香港悦泰洋行公司产品。

    RPMI1640培养基购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司，胰蛋白酶购自上海生工生物工程有限公司，台盼蓝染料(Trypan Blue)购自Sigma公司，姬姆沙瑞氏染料(Giemsa stain)购自BBI公司，t-PA试剂盒购自福建太阳生物技术有限公司。

SurgetakeTM：山西皮尔复生物技术有限公司提供，为高分子多糖复合物，独创专有产品。

1.2动物与细胞生物：

北京友谊医院实验动物室提供：1、新西兰白兔  体重3.00±0.10 kg；2、杂种犬：15.00±1.50 kg；

wister大鼠   上海医科大学实验动物中心；

细胞株：人膀胱癌细胞株T24，购自中科院上海生命科学研究院；

麻醉：1、鼠、兔 用戊巴比妥钠麻醉；2、犬 硫喷妥钠静脉全麻；

2、方法

2.1组织极性修复组：

2.1.1兔造模：20只新西兰白兔随机分为两组：极性修复组与对照组。两组均接受相同的手术，即：开腹后于右下腹寻见盲肠，在盲肠临贴右侧腹壁处剥离一个结肠带的范围约2×3cm的间皮组织（浆膜），再在盲肠浆膜剥离面表面的相对的右腹壁剥去壁层浆膜（间皮组织）3×4cm，间皮组织完全剥离完成以后，将两个完全没有间皮组织的裸面相对贴临，两组分别用SurgetakeTM或生理盐水进行冲洗（灌入），用量均为10ml/kg，将两个裸面摆放在相对位置相贴后关腹

2.1.2犬造模：20只杂种犬随机分为两组：极性修复组与对照组。两组均接受相同的手术，即：开腹后于右下腹寻见盲肠，在盲肠临贴右侧腹壁处剥离一个结肠带的范围约3×4cm的间皮组织（浆膜），再在盲肠浆膜剥离面表面的相对的右腹壁剥去壁层浆膜（间皮组织）4×5cm，间皮组织完全剥离完成以后，将两个完全没有间皮组织的裸面相对贴临，两组分别用SurgetakeTM或生理盐水进行冲洗（灌入），用量均为10ml/kg，将两个裸面摆放在相对位置相贴后关腹。

2.1.3间皮组织极性修复指标：术后14天再次手术开腹，判断腹腔间皮缺损部位间皮组织细胞保持原有极性（两侧间皮细胞游离面相对）的修复程度，进行分级判定：0级：相对两侧大面积间皮组织缺损部位被间皮组织被覆，保持其连续性完整性，游离面完好光滑； 1级：形成两层间皮组织结构，完整但游离面粗糙或增厚，少量有疏松粘连，钝性分离容易分开；2级：裸面之间间皮组织细胞增生两侧融合，钝性可分开，但较困难；3级：两侧间皮组织细胞细胞排列紊乱有结缔组织增生，需锐性分离；4级：两侧裸面组织相互融合紧密，锐性分离困难。同时，两侧造模面组织进行光镜组织学检查。

2.2消化道吻合口愈合影响试验

2.2.1造膜，犬10只，随机分为两组，实验组与对照组，切除空肠一段约10cm，即进端端肠管吻合，首先，用1－0丝线间断内翻缝0合肠壁全层，再用1－O丝线间断缝合肠壁浆肌层，手术完成以后两组分别用SurgetakeTM或生理盐水进行腹腔冲洗。

2.2.2肠管吻合口愈合指标检测：切取肠吻合处肠管(吻合口远、近端各10cm)，取材时注意保留吻合和粘连组织，用拉力仪测定吻合口张力。

2.3 SurgetakeTM对“T”管窦道形成试验

2.3.1造模：10只杂种犬随机分为两组：实验组和对照组，两组均接受相同的手术，即：胆总管切开，放入外径3mm的“T”管，缝合固定，“T”管长臂末端结扎闭死，埋置于切口外侧皮下，手术完成以后两组分别用surgetakeTM和生理盐水进行腹腔冲洗。

2.3.2观察与评价：手术后第14天，切开皮肤，寻找“T”管末端并拔除之，观察胆汁流出情况，再次手术开腹观察“T”管窦道被膜（间皮组织）修复完整情况，是否游离面光滑

所有手术在手术后观察阶段以及再次手术开腹时密切观察有无全身、腹腔内粘连和切口挆裂、在手术后观察阶段以及再次手术开腹时密切观察有无全身、腹腔内和切口出血等异常。

2.4细胞极性修复相关指标方法：

2.4.1造模：wister大鼠40只雌雄个半，分SurgetakeTM与生理盐水（对照）组，每组20只，打开腹腔后到回盲部，距盲端1-2cm接扎，剪去盲端多余部分，露出肌层，放回原位并用刀柄抹擦破坏其周围间皮组织（浆膜），分别在局部灌入SurgetakeTM或生理盐水，剂量为1.5ml/100g，置引流管后关腹。夹闭引流管并固定。

2.4.2方法：

2.4.2.1抽取引流液，处理标本后用酶标仪测定A405值，并由标准曲线转换成t-PA值进行计算。

2.4.2.2一周后脱臼处死大鼠，打开腹腔检查间皮组织极性修复情况。

2.4.3数据处理组间比较用t检验。极性修复的t-PA界值划分的区分能力用ROC分析，计算每个t-PA值的敏感性和特异性，求最大的Snm值作为区分界值，用z检验确定t-PA指标在评价其间皮组织极性修复中的准确性，编程计算。

2.5 永生化细胞（人膀胱癌细胞株T24）抑制试验

2.5.1实验方法：

2.5.2.1取对数生长期的T24细胞，消化、收集细胞、1000rp/5min离心，用1640培养基调整细胞浓度为1×106/ml。

2.5.2.2 向2个培养瓶中分别加入细胞悬液1ml，实验瓶中再加入3.5ml1640培养基和0.5mlSurgetakeTM溶液，使SurgetakeTM浓度为10%，对照瓶中再加入4ml1640培养基，混匀，放置在37℃、5%CO2培养箱中常规培养。待SurgetakeTM作用T24细胞17h后，倒置显微镜下观察细胞生长情况，分别在高倍镜下随机选取3个视野，计数细胞总数，比较两组细胞的数量。另外，向2个离心管中分别加入细胞悬液2ml，实验管中再加入2ml SurgetakeTM溶液，使SurgetakeTM浓度为50%，对照管再加入2ml生理盐水，混匀，放置在培养箱中，0分钟作为基本对照，分别于药物作用20min、40min、60min、80min、100min、200min、300min、400min、500min、1000min时，每管取100µl 的细胞悬液，加等量的台盼蓝染色计数细胞，置100倍光学显微镜下计数4个大格内的细胞总数，分别计数活细胞（未着色的细胞）和死细胞（染成蓝黑色的细胞）数，计算细胞死亡率。50%的SurgetakeTM作用T24细胞1000min后，做细胞推片，无水乙醇固定，姬姆沙瑞氏染色，光学显微镜下细胞形态观察。

2.5.2.3细胞死亡率=死细胞数/（死细胞数+活细胞数）×100%。

2.5.2.4T24镜下形态学观察分析。

3结果

3.1间皮组织极性修复试验

3.1.1兔实验结果见表1：

表1  SurgetakeTM对家兔腹腔间皮组织极性修复评分

兔实验组腹腔间皮组织极性修复明显优于对照组（P＜0.01) 。对切取的盲肠剥离面和右侧腹壁剥离面标本进行光镜组织学检查表明：实验组10例未形成粘连的两侧剥离面已形成连续完整的浆膜组织。而对照组只有1例无粘连形成，但两侧虽有单层上皮组织出现，但不够完整，其间混有纤维结缔组织；对照组形成粘连的两侧剥离面主要为数量不等的纤维结缔组织，少见上皮（间皮）组织，而且，对照组有2例在实验中引起粘连梗阻死亡。

3.1.2犬实验结果：实验室剥离了间皮组织后相贴的两侧裸面各自被覆了一层间皮组织，两侧间皮组织没有相融，各自游离，游离面光滑。对照组两侧裸面组织相融，形成腹膜后位融合。

3.2 消化道吻合口试验结果：

表2、SurgetakeTM对小肠吻合口愈合的影响

两组吻合口张力无显著差异（P=0.626)

3.3“T”管窦道形成试验结果

两组10条犬在“T”管拔除以后均有胆汁自窦道口流出，开腹后均见围绕原“T”管放置处形成完整窦道，无胆汁流入腹腔，“T”管周围均有网膜组织粘连。实验组腹腔内“T”管周围形成紧密光滑的解剖形窦道表面被覆一层完整的浆膜（间皮组织）。

3.4细胞极性修复相关指标

3.4.1实验组20只大鼠造模部位间皮组织完整，脏层与壁层腹膜保持原有的极性，游离光滑无融合与粘连形成。对照组20只大鼠全部形成广泛的盲端肌层与腹壁、壁层与脏层、脏层与脏层之间的间皮组织紊乱、结缔组织融合，见表3：

表3、SurgetakeTM间皮组织极性情况

3.4.2两组间皮组织极性修复的相关指标比较见表

                 表4、两组间皮组织极性修复的相关指标比较

P＜0.01

3.4.3 ROC法分析结果：W=0.764，SEw=0.0837,z =3.16, p＜0.01,表明t-PA活性的测定对大鼠腹腔间皮组织极性修复具有区分能力。见下图：

3.5永生化细胞（人膀胱癌细胞株T24）抑制试验

实验结果：

3.5.1倒置显微镜下可见对照瓶细胞贴壁良好，呈梭形，10%surgetake作用T24细胞17h后，实验瓶细胞多数呈圆形，贴壁不良，呈漂浮状态（图1）。表明surgetake对肿瘤细胞的种植有抑制作用。

A对照组                                    B实验组

图1 SurgetakeTM作用T24细胞17h后细胞图

3.5.2  surgetake组3个视野计数细胞总数为844个，对照组3个视野细胞总数为2295个，对照组/surgetake组=2.72，细胞数量对比显示出surgetake对肿瘤细胞生长具有一定的抑制作用，见表6。

3.5.3  50%SurgetakeTM作用T24细胞不同时间，在300min时，细胞死亡率最高（表7、图2）。

表7  surgetake对T24细胞的杀伤作用

                            图2 surgetake对T24细胞的杀伤作用

    3.5.4、50%的SurgetakeTM作用T24细胞1000min后，实验组细胞核固缩，实验组T24细胞核体积较对照组明显减小，胞体明显小于对照组，实验组细胞胞浆出现，有可见正常细胞形态趋势。对照组T24肿瘤细胞核满盈，无胞浆，显示核酸合成十分的旺盛，可见较多分裂相细胞。形态学与对照组出现明显差异。

                              实验组                                   对照组                 

                                       图3 姬姆沙瑞氏染色后光镜下细胞形态

实验结果表明：组织的极性修复，可使相邻的剥离了间皮组织的相贴的裸面在修复过程中，实现了间皮细胞的附着面与剥离的浆基层的裸面相附着，附着面相背，间皮细胞的游离面（分泌面）相对，保持了间皮细胞的极性，实现了间皮结构的重建。细胞的极性保持过程与小分子蛋白t-PA相关，这一过程——极化作用可使肿瘤细胞恶性程度降低，其表现为：肿瘤细胞形态变小；细胞核缩小；核膜与细胞膜分离，从而胞浆出现可使T24肿瘤细胞形态学改变，趋向正常细胞形态的趋势明显，对肿瘤细胞的种植具有抑制，减少肿瘤细胞数量的增殖，增加肿瘤细胞的死亡。

4讨论

细胞的核外结构是细胞正常生理功能实现的重要区域，并确定了细胞的三维结构不同部位的功能，这种特征就是细胞的极性。我们选择间皮细胞，因为间皮细胞游离面具有分泌功能，能实现与组织的分离（游离），附着面能实现与肌组织的附着，其细胞的周边连接面能保持与间皮细胞的连接实现其连续性与完整性，依据其特征分析细胞极性。通过保持与恢复间皮细胞的极性实现了间皮组织结构的重建。实验表明，这种作用对于肿瘤细胞具有明显的逆转效应——极性恢复的特征表现：1、增殖抑制；2、种植抑制；3、核抑制与胞浆的出现。永生化细胞表现为核物质的疯狂复制，核外结构受到抑制甚至消失，而正常细胞（极性细胞）的代谢、功能蛋白的合成主要场所在核外结构——胞质，核外结构丰富，胞质薄膜结构的方向性体现出细胞结构的极性，所以，细胞核的缩小与胞浆的出现伴随着的是肿瘤细胞恶性程度的降低。

    通过大体病理研究、分子生物学实验与肿瘤细胞学实验标明，细胞的极性恢复，无论对于组织结构重建，还是恶性肿瘤的转归都具有重要意义，而且，细胞极性不同程度的恢复影响对肿瘤细胞具有逆转效应。

细胞失去极性呈现永生化，在物种水平上体现了它以一种最小的消耗方式保持了该物种全部遗传信息的存在与生命的存续，并且，表现对增殖环境具有较强的自适应性与跨物种种植与寄生的特征，所以，肿瘤细胞的存在是生命存在的另一种形式。而一个机体的细胞只能体现其在某一器官中具有特定的功能与被限制了的生存期。从群论的角度分析，这两者之间之间的化学过程存在对称操作——相互转化。其过程的揭示，将会改变对恶性肿瘤治疗的方式，同时，恶性肿瘤细胞的定向极化将可作为人体修复的组织来源。

参考文献：

1、王民 潘玲 脱乙酰的甲壳素衍生物——羧甲基壳聚糖的不良反应  中国药物与临床  2009  9（7） 549~552

2、王民 周宏涛  术尔泰腹腔冲洗后炎症指标与组织型纤溶酶原激活物活性观察分析  中国药物与临床  2011  11（9）1055~1056

作者单位：

1、山西皮尔复临床医药研究所中心研究室；2、上海中医药大学临床药理研究中心；3、首都医科大学附属北京友谊医院外科；4、山西省肿瘤医院肿瘤研究室

联系方式：wangmin7878@126.com；13835178783